酵母雙雜交檢測實驗技術(shù)服務(wù)

　　隨著分子生物學(xué)研究尤其是人類基因組計劃的迅速發(fā)展，為適應(yīng)對眾多基因或蛋白進(jìn)行功能研究的發(fā)展趨勢，已出現(xiàn)了很多新技術(shù)。其中酵母雙雜交技術(shù)以其簡便，靈敏，高效以及能反映不同蛋白質(zhì)之間在活細(xì)胞內(nèi)的相互作用等特點在基因功能的研究中得到了廣泛的應(yīng)用。

　　蛋白的酵母雙雜交實驗是以酵母的遺傳分析為基礎(chǔ)，研究反式作用因子之間的相互作用對真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控影響的實驗，同以往研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間相互作用的實驗手段相比，酵母雙雜交系統(tǒng)具有其*優(yōu)勢。

1、融合體蛋白之間的相互作用是在真核酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，蛋白質(zhì)保持天然的折疊狀態(tài)，這是其他離體生化檢驗方法所缺乏的，它所證實的蛋白質(zhì)間相互作用將更接近于體內(nèi)的真實水平。
2、雙雜交系統(tǒng)的敏感度非常高，蛋白質(zhì)之間結(jié)合常數(shù)低至1mmol/L時都可以被偵測。
3、在篩選cDNA 文庫時，雙雜交系統(tǒng)能夠簡捷地得到編碼相互作用蛋白的基因序列，它只需構(gòu)建質(zhì)粒而不必準(zhǔn)備抗體或純化蛋白，省略了其它體外檢測蛋白之間相互作用方法所必須的蛋白抽提、純化等繁瑣步驟。

酵母雙雜交實驗原理：

　　以Gal4系統(tǒng)為例，BD和AD分別由Gal4蛋白上不同的兩個結(jié)構(gòu)域(1-147aa與768-881aa)構(gòu)成。在利用GAL4系統(tǒng)篩選cDNA文庫或研究蛋白間的相互作用時，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶蛋白即"誘餌"相結(jié)合，轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域與文庫蛋白或要驗證的蛋白相結(jié)合。一般情況下，單獨的BD可以與GAL4上游活化序列（GAL UAS）結(jié)合但不能引起轉(zhuǎn)錄，單獨的AD則不能與GAL UAS結(jié)合；只有當(dāng)BD與AD分別表達(dá)的融合蛋白由于相互作用而導(dǎo)致兩者在空間上相互靠近時，BD與AD才能與GAL UAS結(jié)合并且引起報道基因的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游報告基因，通過這一系列實驗來驗證兩個蛋白之間的相互作用。

★ 酵母單/雙雜交檢測服務(wù)項目列表

服務(wù)一、酵母單雜交文庫構(gòu)建服務(wù)

　　酵母單雜交體系能在一個簡單實驗過程中，識別與DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)，同時可直接從基因文庫中找到編碼蛋白的DNA序列，而無需分離純化蛋白，實驗簡單易行。為了獲得良好的酵母單雜交篩選實驗結(jié)果，構(gòu)建酵母單雜的文庫至關(guān)重要，我們可以依據(jù)不同的實驗需要及物種特性，選擇不同的體系建庫方法，我們的技術(shù)專家可以熟練的應(yīng)用Clonetech的SAMRT方法和life的gateway方法建立，同時，我們的技術(shù)專家也開發(fā)出了基于同源重組原理的建庫方法。

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗流程： 
 1. RNA提取 
 2. mRNA提取 
 3. cDNA的酶促法合成
 4. cDNA連接接頭 
 5. cDNA按長度分離 
 6. cDNA與酵母單雜交文庫載體pGADT7進(jìn)行all-direct重組 
 7. 重組產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化 
 8. 文庫檢測以及質(zhì)粒提取

★ 酵母單雜交文庫構(gòu)建實驗材料要求： 

客戶構(gòu)建的酵母單雜交cDNA文庫，由客戶提供組織、細(xì)胞或總RNA給我們即可：

細(xì)胞樣本：細(xì)胞數(shù)量大于1*10^7；

動物樣本：大于1g；

植物樣本：大于2g；

總RNA：大于200ug。

★ 產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：

 原始文庫庫容量大于1*10^7CFU；
 平均插入片段大于1000bp ；
 克隆陽性率大于95%。

服務(wù)二、酵母單雜交文庫篩選技術(shù)服務(wù)

在研究DNA—蛋白質(zhì)相互作用中，酵母單雜交體系主要有以下3種用途：

①確定已知DNA—蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用；②分離結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因；③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及準(zhǔn)確定位與DNA結(jié)合的核苷酸序列。

客戶僅提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：
 1. 誘餌載體的構(gòu)建
 2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
 3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞
 4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
 5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
 6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
 7. 詳細(xì)報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

試驗完成后提供完整的實驗報告，包含實驗原始圖片，陽性克隆，測序鑒定結(jié)果，質(zhì)粒及菌株等。

服務(wù)三、核蛋白體系酵母雙雜交文庫篩選技術(shù)服務(wù)

　　艾柏森生物的核蛋白體系酵母雙雜交服務(wù)可以選擇使用life的pDEST22和clonetech的pGADT7兩套系統(tǒng)進(jìn)行篩選，篩選文庫可以使用預(yù)制商業(yè)化文庫或者本公司定制構(gòu)建的酵母雜交文庫。 
　 需要指出的是，融合體蛋白必須轉(zhuǎn)運至核內(nèi)才能活化轉(zhuǎn)錄，因此對于胞外配體-受體作用以及需要核外修飾或受磷酸化等翻譯后修飾過程介導(dǎo)的蛋白質(zhì)間相互作用而言，該系統(tǒng)的應(yīng)用受到一些限制。在進(jìn)行文庫篩選時，假陽性結(jié)果常常干擾實驗的準(zhǔn)確性，除某些文庫編碼的蛋白質(zhì)本身含有轉(zhuǎn)錄活化成分外，細(xì)胞內(nèi)的其它無關(guān)蛋白也可能有類似作用，因此雙雜交系統(tǒng)檢測的結(jié)果必須通過其它蛋白間相互作用的實驗來進(jìn)一步驗證。

客戶只需提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：

 1. 誘餌載體的構(gòu)建
 2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
 3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞
 4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
 5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
 6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
 7. 詳細(xì)報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

服務(wù)四、膜蛋白體系酵母雙雜交文庫篩選技術(shù)服務(wù)

　　該系統(tǒng)的原理是利用連接有泛素(ubiquitin)的蛋白能夠被泛素特異性的蛋白酶(UBPs)識別并切割下泛素，而這種特異性切割只在泛素能夠正確折疊的前提下發(fā)生。在正常情況下，泛素斷裂成兩部分后在體內(nèi)能自發(fā)結(jié)合成可被 UBPs識別的重構(gòu)泛素，而當(dāng)有突變發(fā)生時，即泛素的N端發(fā)生Ile13/Gly13的突變,這種斷裂泛素的重構(gòu)就無法進(jìn)行。 只有當(dāng)與斷裂的泛素的兩部分分別連接一個蛋白，且兩個蛋白之間存在相互作用,斷裂泛素的重組又得以恢復(fù)。斷裂泛素重組的發(fā)生能將連接在泛素C端的轉(zhuǎn)錄因子切割并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活報告基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通過報告基因是否表達(dá),可以檢測兩個蛋白之間是否存在相互作用

　　基于分離的泛素(split-ubiquitin)介導(dǎo)的膜蛋白酵母雙雜交系統(tǒng)，區(qū)別于傳統(tǒng)的核蛋白互作分析，可用于研究膜蛋白間及膜蛋白與胞質(zhì)蛋白間的互作。在酵母細(xì)胞中，泛素可以分成兩部分表達(dá)，即其N端部分(NubI)和C端部分(Cub)，后者融合有能啟動核內(nèi)報告基因表達(dá)的LexA蛋白。NubI和Cub-LexA在細(xì)胞中組成可分離的泛素蛋白體系

客戶只需提供用于篩選的誘餌質(zhì)粒信息，我們完成雜交篩選相關(guān)工作：
1. 誘餌載體的構(gòu)建
2. 誘餌質(zhì)粒的自激活檢測
3. 文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒共轉(zhuǎn)酵母感受態(tài)細(xì)胞
4. 文庫篩選和3AT優(yōu)化
5. 文庫篩選結(jié)果測序分析
6. 篩選結(jié)果回轉(zhuǎn)驗證
7. 詳細(xì)報告的整理和數(shù)據(jù)發(fā)送

客戶案例1——

★　酵母雜交文庫構(gòu)建服務(wù)案例（限于篇幅，我們只選取了實驗報告中部分步驟，如果需要了解更多的實驗信息，請聯(lián)系客服人員）

一、試劑、耗材（略）
二、儀器設(shè)備（略）
三、試劑及配制 （略）
四、酵母雜交文庫構(gòu)建實驗流程
1、Trizol法RNA的提取
2、使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分離純化樣本的mRNA，mRNA質(zhì)量可以滿足文庫要求，mRNA總量為6.9 ug 
3、酵母雙雜交文庫構(gòu)建
3.1、di一鏈cDNA合成
3.2、cDNA第二鏈的合成
3.3、加5’接頭(3個讀碼框，每個讀碼框連接一份，共3份)
3.4、cDNA長度分離, 使用低熔點瓊脂糖電泳cDNA，切膠回收1 Kbp以上的條帶，乙醇沉淀后溶于14 ul水中。
3.5、使用Infusion重組反應(yīng)體系連接cDNA與載體pGADT7
3.6、電轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞
4、酵母雙雜交文庫的構(gòu)建質(zhì)量鑒定
4.1、庫容量的鑒定
取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 uL稀釋100倍后，從中取出10 uL涂布LB平板（含氨芐抗性），第二天計數(shù)。
CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/10 uL×100倍×1×103 uL
文庫總CFU= CFU/mL×文庫菌液總體積（mL）
4.2、插入片段大小鑒定
從轉(zhuǎn)化平板上隨機挑取24個單克隆菌落，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，用電泳檢測PCR產(chǎn)物大小。

五、文庫擴(kuò)增及質(zhì)粒提取
將轉(zhuǎn)化后原始文庫菌液涂布氨芐抗性培養(yǎng)基平板擴(kuò)增培養(yǎng)，第二天用液體培養(yǎng)基從平板上洗脫菌苔，取其中2/3體積用Qiagen大抽試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，剩余1/3體積中加入25%無菌甘油混合均勻后灌裝保種管，凍存于-80℃冰箱。
六、文庫菌保存和文庫篩選
凍存于-80℃冰箱內(nèi)，可以保存2年以上，文庫質(zhì)?？梢灾苯佑糜诮湍肝膸旌Y選，pGADT7 酵母雙雜交文庫菌的抗性為氨芐抗性（50 ug/mL）

備注：
 1. 文庫構(gòu)建使用的引物序列，雙雜交文庫擴(kuò)增檢測引物：
 F：5′-TAATACGACTCACTATAGGGCGAGCGCCGCCATG-3′
 R：5′-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT-3′  
如果需要對文庫中的克隆質(zhì)粒進(jìn)行測序，請使用以下引物：
 T7：TAATACGACTCACTATAGGGC
 ADR：GTGAACTTGCGGGGTTTTTC

客戶案例2——

★ 酵母雙雜交文庫篩選ORF1的相互作用蛋白服務(wù)案例

一、試劑、耗材（略）儀器設(shè)備（略）試劑及配制（略）
二、誘餌載體構(gòu)建pGBKT7- ORF1的構(gòu)建與鑒定（此步驟為常規(guī)的實驗方法，可以通過酶切、測序等方法鑒定酵母雜交誘餌載體正確性，此處略）
三、ORF1自激活檢測
1、酵母轉(zhuǎn)化反應(yīng)
將各種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入受體菌AH109中，觀察檢測結(jié)果。

2、酵母轉(zhuǎn)化方法
 1. 從YPDA平板挑取AH109單菌落接種于YPDA液體培養(yǎng)基4 ml，30℃，225 rpm，振蕩培養(yǎng)18-20 h（過夜），至OD600>1.5，一般為4左右。
 2. 轉(zhuǎn)接YPDA液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)體積為50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振蕩培養(yǎng)4-5h，至OD600=0.6。
 3. 離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min。
 4. 用20 ml無菌水重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 6. 用500 ul 0.1 M LiAc重懸菌體，混勻，分裝至1.5 ml離心管，每個50 ul（每個轉(zhuǎn)化），備用。
 7. 每個1.5 ml離心管中依次加入相應(yīng)試劑，用槍頭吹打混勻，或劇烈振蕩1 min左右，至*混勻。
 8. 30℃水浴孵育，30 min。
 9. 42℃水浴熱激，25 min。
 10. 30℃水浴復(fù)蘇，30 min。
 11. 離心收菌，室溫，4000 rpm，5 min，棄上清。
 12. 每個轉(zhuǎn)化用200 ul無菌水懸浮菌體，盡量溫和地混勻，涂布相應(yīng)的缺陷型篩選平板。
 13. 30℃恒溫培養(yǎng)4天。
3、ORF1自激活檢測結(jié)果
pGBKT7-ORF1 + pGADT7共轉(zhuǎn)化AH109長出的酵母轉(zhuǎn)化子隨機挑取了6個菌落進(jìn)行自激活檢測。包括HIS3、ADE2和LacZ共3個報告基因的檢測。
HIS3和ADE2的檢測采用點板培養(yǎng)的方法，將轉(zhuǎn)化子點板至SD-TLHA平板，30℃恒溫培養(yǎng)4天，觀察其生長狀態(tài)。
LacZ報告基因的檢測方法如下：
 1. 從轉(zhuǎn)化平板隨機挑取6個菌落于濾紙片上。
 2. 將濾紙*浸于液氮中90 s，取出常溫放置2 min晾干。
 3. 在培養(yǎng)皿中加入新鮮配制的顯色液，一般9 cm培養(yǎng)皿用2-3 ml顯色液。
4、將顯色液加入培養(yǎng)皿中，再放入一張干凈的濾紙，讓其*浸濕，將凍溶后的濾紙放在上面，使顯色液浸透表層，蓋上皿蓋。30℃避光培養(yǎng)，20 min后開始觀察，一般2 h后可開始看到顏色變化。4-5h拍照記錄結(jié)果。

對照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照可在SD-TLHA缺陷平板生長。pGBKT7-ORF1  +pGADT7轉(zhuǎn)化子中隨機挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態(tài)同陰性對照，LacZ檢測中結(jié)果也與陰性對照相同，因此不存在自激活。

自激活檢測結(jié)論：ORF1誘餌克隆沒有自激活作用。

四、文庫篩選 
用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將文庫質(zhì)粒pGADT7-酵母雙雜-cDNA轉(zhuǎn)入其中，涂SD-Trp-Leu-His+  5 mM 3AT平板。

五、影印清除
為了消除背景生長菌落的干擾，在培養(yǎng)到第3天時，用絨布對篩庫平板進(jìn)行影印清除后，繼續(xù)培養(yǎng)7-14天。分批挑取再次長出的轉(zhuǎn)化子菌落進(jìn)行下一步檢測。

六、陽性克隆鑒定
至影印清除后繼續(xù)培養(yǎng)7-14天，從篩庫平板中挑取長出的陽性克隆單菌落，共挑取到20個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到SD-TL缺陷型平板中繼續(xù)培養(yǎng)2-3天。
1.　陽性克隆His和Ade報告基因的檢測 
將上述SD-TL缺陷型平板上長出的20個初始陽性克隆轉(zhuǎn)化子分別用無菌水稀釋后點種至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒溫培養(yǎng)3-4天。

陽性克隆檢測結(jié)果顯示：在20個初始陽性克隆中，有13個能在SD-TLHA生長的是激活了ADE2和HIS3報告基因。

2.　陽性克隆LacZ報告基因檢測
將20個初始陽性克隆用無菌水重懸后點于濾紙片上進(jìn)行LacZ報告基因檢測。結(jié)果如下圖所示：

七、酵母陽性克隆DNA提取和測序比對

通過測序比對，可以將重復(fù)的陽性給克隆子去除，本實驗案例中，有多個克隆子為重復(fù)的陽性克隆，經(jīng)過篩除后，我們可以確認(rèn)獲得了6個*不同的陽性克隆子。

八、回轉(zhuǎn)驗證
用含有正確pGBKT7-ORF1誘餌質(zhì)粒的AH109酵母轉(zhuǎn)化子作為受體菌制備感受態(tài)，將6種陽性克隆質(zhì)粒DNA分別轉(zhuǎn)化其中，分別回轉(zhuǎn)驗證His和Ade報告基因的檢測和LacZ報告基因檢測。

實驗結(jié)論：

本項目以O(shè)RF1基因cDNA克隆為誘餌，篩選cDNA酵母雙雜交文庫，在篩選到的20個初始陽性中，經(jīng)過鑒定結(jié)果顯示有13個能激活A(yù)DE2、HIS3和LacZ報告基因。經(jīng)過對這些陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行DNA測序和BLAST比對分析，結(jié)果表明它們分別屬于6種不同蛋白的編碼基因。

通過對這6種陽性克隆的回轉(zhuǎn)驗證檢測，結(jié)果顯示所有陽性克隆都能通過對ADE2、HIS3和LacZ報告基因的回轉(zhuǎn)驗證。